Μικροβιολογικές Αναλύσεις στον Οίνο

Στον οίνο η ύπαρξη μικροοργανισμών είναι απαραίτητη. Χωρίς την ύπαρξή τους μάλιστα η παραγωγή ποιοτικών οίνων θα ήταν αδύνατη.

Έτσι κάποιοι μικροοργανισμοί είναι απαραίτητοι ενώ κάποιοι άλλοι είναι ανεπιθύμητοι. Με μικροβιολογικές αναλύσεις στους οίνους είναι δυνατόν να προσδιοριστεί το είδος μικροοργανισμών που βρίσκονται στον οίνο καθώς και οι συγκέντρωση αυτών.

Παρακάτω αναλύονται τα διάφορα είδη μικροοργανισμών που συναντώνται στους οίνους:

Ζύμες

Υπάρχουν αρκετά είδη ζυμών τα οποία δρουν κατά τη διάρκεια της οινοποίησης και έχουν τόσο θετικό όσο και αρνητικό αντίκτυπο στην ποιότητα των οίνων. Από τα 590 περίπου είδη ζυμών, μερικά μόνο υπάρχουν στα γλεύκη και είτε συμμετέχουν ενεργά στη διαδικασία της αλκοολικής ζύμωσης είτε είναι υπεύθυνα για τις διάφορες ασθένειες του οίνου.

Οι άγριες ζύμες χρειάζονται οξυγόνο για να αναπτυχθούν και να δράσουν. Μόλις έρθουν σε επαφή με τα σάκχαρα του γλεύκους τα μετατρέπουν σε αιθανόλη, με τη διαδικασία της αλκοολικής ζύμωσης. Η ανθεκτικότητά τους στην αιθανόλη είναι περιορισμένη και όταν η συγκέντρωσή της υπερβεί τους 4 αλκοολικούς βαθμούς, τότε οι άγριες ζύμες πεθαίνουν.

Από το σημείο αυτό και μετά, οι ζύμες οινοποίησης του γένους Saccharomyces, των οποίων η συμμετοχή στα αρχικά στάδια της αλκοολικής ζύμωσης είναι μικρή, αναλαμβάνουν να συνεχίσουν τη διαδικασία της αλκοολικής ζύμωσης και συνήθως την ολοκληρώνουν, ώσπου να καταναλωθούν πλήρως τα ζυμώσιμα σάκχαρα του γλεύκους.

Το μέγεθος των ζυμών κυμαίνεται από 4μm έως 15μm και είναι Gram (+).

Γαλακτικά Βακτήρια

Τα γαλακτικά βακτήρια υπάρχουν στα γλεύκη και στους οίνους. Είναι μονοκύτταροι μικροοργανισμοί στους οποίους ο πυρήνας διακρίνεται δύσκολα. Τα γαλακτικά βακτήρια που υπάρχουν στα γλεύκη και στους οίνους ανήκουν σε δύο οικογένειες, τη Lactobacillaceae και τη Lactobacillus.

Η δυνατότητα ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων επηρεάζεται από το στάδιο της οινοποίησης και τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Όταν αναπτύσσονται έχουν τη δυνατότητα να μεταβολίσουν διάφορα υποστρώματα (κυρίως τα σάκχαρα και το L-μηλικό οξύ), με τελικό προϊόν το γαλακτικό οξύ. Η παρουσία ορισμένου είδους γαλακτικών βακτηρίων σε συγκεκριμένους οίνους είναι επιθυμητή (π.χ. μηλογαλακτική ζύμωση), ενώ σε άλλες περιπτώσεις η παρουσία και δράση ορισμένου είδους γαλακτικών βακτηρίων είναι ανεπιθύμητη.

Τα βακτήρια στο μικροσκόπιο διακρίνονται σε κόκκους και βάκιλους. Οι κόκκοι έχουν σχήμα σφαιρικό και διάμετρο που κυμαίνεται από 0.4 μm έως 1μm, ενώ οι βάκιλοι, έχουν σχήμα ράβδου με πάχος περίπου 0.5μm και μήκος που κυμαίνεται από 2 έως 5μm και είναι Gram (+).

Οξικά βακτήρια

Τα οξικά βακτήρια είναι αρκετά διαδεδομένα στη φύση και βρίσκονται ακόμα και στην επιφάνεια των σταφυλιών. Μπορούν να αναπτυχθούν τόσο σε περιβάλλον πλούσιο σε σάκχαρα όσο και σε αιθανόλη. Στον οίνο η παρουσία των οξικών βακτηρίων είναι ανεπιθύμητη καθώς μετατρέπουν την αλκοόλη σε οξικό οξύ. Η αντίδραση αυτή ονομάζεται οξική ζύμωση και απαιτεί αερόβιο περιβάλλον για να πραγματοποιηθεί. Για τον λόγο αυτό τα οξικά βακτήρια αναπτύσσονται ταχύτατα στην επιφάνεια των οίνων, σχηματίζοντας μια μεμβράνη. Η προστασία του οίνου από το οξυγόνο, είναι ο κυριότερος τρόπος αντιμετώπισης της δράσης των οξικών βακτηρίων.

Τα οξικά βακτήρια ανήκουν στην οικογένεια των Acetobacteraceae και διακρίνονται στα γένη Acetobacter και Gluconobacter. Για την ανάπτυξή τους, το γένος Acetobacter, προτιμά να μεταβολίζει την αιθανόλη, γι’αυτό και εμφανίζεται κυρίως στα ζυμούμενα γλεύκη και τους οίνους ενώ το γένος Gluconobacter, προτιμά να μεταβολίζει τα σάκχαρα και για το λόγο αυτό εμφανίζεται κυρίως στο αζύμωτο γλεύκος.

Οι βέλτιστες τιμές pH για την ανάπτυξη των οξικών βακτηρίων είναι από 5 έως 6, αλλά η πλειοψηφία των στελεχών μπορεί εύκολα να αναπτυχθεί και σε όξινο περιβάλλον, σε τιμές pH μέχρι και 3.5.

Τα οξικά βακτήρια είναι μονοκύτταροι αερόβιοι μικροοργανισμοί. Το μέγεθός τους κυμαίνεται από 0.6 μm έως 4 μm και είναι Gram (-).

Ανάπτυξη ζυμομυκήτων κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης

Στο ξεκίνημα της διαδικασίας παραγωγής του οίνου, οι ζυμομύκητες μεταβολίζουν τα σάκχαρα και τα άλλα θρεπτικά συστατικά του γλεύκους για να αποκτήσουν ενέργεια και να αυξήσουν τον πληθυσμό τους.

Έτσι παρατηρούνται οι εξής φάσεις στον κύκλο ανάπτυξης των ζυμών:

Λανθάνουσα φάση: Είναι οι πρώτες ώρες της ζύμωσης, όπου τα κύτταρα προσαρμόζονται στο νέο περιβάλλον και ο πληθυσμός των ζυμών δεν αυξάνεται.

Φάση λογαριθμικής ανάπτυξης: Από τη στιγμή που οι ζύμες προσαρμοστούν στις νέες συνθήκες τότε αρχίζουν να αναπτύσσονται. Αυτή η περίοδος μπορεί να διαρκέσει από 3 μέχρι 6 ημέρες και εξαρτάται από τη θερμοκρασία, την συγκέντρωση των αμινοξέων, της αμμωνίας και άλλων θρεπτικών συστατικών και από την παρουσία οξυγόνου.

Φάση στασιμότητας: Ο πληθυσμός των ζυμών παραμένει σχεδόν σταθερός καθώς κάποια από τα θρεπτικά συστατικά έχουν καταναλωθεί πλήρως. Η φάση αυτή διαρκεί από 2 μέχρι 10 μέρες.

Φάση μείωσης: Ο πληθυσμός των ζυμών μειώνεται βαθμιαία μέχρι σχεδόν να μηδενιστεί. Στη διάρκεια της φάσης αυτής οι ζυμομύκητες πεθαίνουν εξαιτίας της έλλειψης των θρεπτικών συστατικών αλλά και εξαιτίας της αύξησης της συγκέντρωσης της αιθανόλης και κάποιων άλλων προϊόντων της αλκοολικής ζύμωσης, ουσίες οι οποίες είναι τοξικές για αυτούς.

Η επιτυχής εξέλιξη της αλκοολικής ζύμωσης, εξαρτάται από τη διατήρηση των πληθυσμών των βιώσιμων κυττάρων σε ικανοποιητικά επίπεδα, μέχρι να καταναλωθούν πλήρως τα ζυμώσιμα σάκχαρα. Στην περίπτωση όπου τα σάκχαρα αυτά δεν καταναλωθούν πλήρως, τότε αντιμετωπίζουμε το σοβαρό πρόβλημα της μη ολοκληρωμένης αλκοολικής ζύμωσης.

Μικροβιολογικές Αναλύσεις στους οίνους

Οι μικροβιακές αναλύσεις που γίνονται στους οίνους και στα γλεύκη αφορούν τον ποσοτικό προσδιορισμό και το είδος των μικροοργανισμών στον οίνο. Παρακάτω αναλύονται 3 μέθοδοι ανάλυσης:

Προσδιορισμός συνολικού αριθμού κυττάρων

Για τη μέθοδο αυτή θα χρειαστείτε:

Πλακίδιο Neubauer
Μικροσκόπιο
Αναδευτήρα Vortex

Ο συνολικός αριθμός των κυττάρων προσδιορίζεται με μέτρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο, με τη βοήθεια αιματοκυτταρόμετρου ή πλακιδίου Neubauer.

Το αιμοκυτταρόμετρο είναι μια διαβαθμισμένη αντικειμενοφόρος πλάκα με δική της καλυπτρίδα, που έχει κατασκευαστεί για την καταμέτρηση κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Στην πλάκα διακρίνεται μια διαγράμμιση σε μορφή τετραγωνισμένου πλέγματος, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα. Το μήκος της πλευράς των τετραγώνων είναι 1mm. Κάθε τετράγωνο ορίζεται από τρεις παράλληλες γραμμές οι οποίες καθορίζουν τη θέση των κυττάρων, ενώ χωρίζεται σε μικρότερα τετράγωνα που αποσκοπούν στην ευκολότερη μέτρηση των κυττάρων.

Το αιμοκυτταρόμετρο αποτελείται από δύο λείες επιφάνειες, οι οποίες προεξέχουν και στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Μεταξύ των λείων επιφανειών και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα, υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια στην οποία τοποθετείται το εναιώρημα με τα κύτταρα.

Ο όγκος του εναιωρήματος που καλύπτει καθένα από τα 9 τετράγωνα είναι 0,0001 mL. Επομένως, η συγκέντρωση των κυττάρων (κύτταρα/mL) στο εναιώρημα θα είναι ίση με τον αριθμό των κυττάρων στο ένα από τα κύρια τετράγωνα πολλαπλασιαμένο επί 10.000. Στην περίπτωση που ο αριθμός των κυττάρων είναι πολύ μεγάλος ο αριθμητικός πολλαπλασιασμός δεν είναι αντικειμενικός και απαιτείται αραίωση του δείγματος. Σε αυτή την περίπτωση η αραίωση θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στους υπολογισμούς.

Το υγρό που πρόκειται να εξεταστεί μικροσκοπικά ανακινείται ζωηρά (συσκευή Vortex), έτσι ώστε να γίνει ομοιόμορφη η κατανομή των κυττάρων. Μια σταγόνα από το υγρό μεταφέρεται με τη βοήθεια ράβδου πάνω στο πλακίδιο και αφού περάσει μικρό χρονικό διάστημα, ώστε να επικαθίσουν τα κύτταρα στην επιφάνεια του πλακιδίου, προβαίνουμε στην αρίθμησή τους.

Κατά τη φάση διπλασσιασμού των κυττάρων, αν το νέο κύτταρο είναι σε μέγεθος όσο το 1/2 του μητρικού, τότε υπολογίζεται ως νέο κύτταρο. Επίσης, αν ένα κύτταρο είναι πάνω στη γραμμή του τετραγώνου και είναι το περισσότερο μέσα στο τετράγωνο, τότε προσμετράται στους υπολογισμούς ενώ σε διαφορετική περίπτωση δεν προσμετράται.

Μέθοδος απομόνωσης στελεχών από ζύμες σε ζυμούμενο γλεύκος

Για τη μέθοδο αυτή θα χρειαστείτε:

τρυβλία πετρί
θρεπτικό υλικό*
μικροβιολογικός κρίκος
επωαστικός θάλαμος
δοκιμαστικοί σωλήνες 5-10 mL
γλυκερίνη

*Το θρεπτικό μέσο εξαρτάται από το είδος του μικροβίου.

Οι μικροοργανισμοί έχουν τη δυνατότητα να αναπαράγονται σε στερεοποιημένο θρεπτικό υλικό το οποίο προηγουμένως έχει αποστειρωθεί. Κάθε ακινητοποιημένο ζωντανό κύτταρο δημιουργεί με την επώασή του μια ορατή αποικία.

Πορεία Μεθόδου:

Με τη βοήθεια του μικροβιολογικού κρίκου εξαπλώνουμε περίπου 10 mL, θρεπτικού υλικού σε τρυβλίο πετρί και αφήνουμε 2-3 μέρες σε επωαστικό θάλαμο στους 27-30 °C, όπου και επωάζει.

Στο τέλος της επώασης φαίνονται καθαρά οι αποικίες. Με την βοήθεια του κρίκου παίρνουμε όσες μπορούμε την κάθεμιά ξεχωριστά και τις βάζουμε σε δοκιμαστικούς σωλήνες που έχουν 3 mL από το θρεπτικό υλικό.

Οι δοκιμαστικοί σωλήνες που περιέχουν από μια και μόνο αποικία αφήνονται για επώαση στον θάλαμο για 24 ώρες σε θερμοκρασία 27-30 °C. Όταν ολοκληρωθεί η επώαση παίρνουμε και πάλι με τον κρίκο μια σταγόνα από τον δοκιμαστικό σωλήνα και την εξαπλώνουμε σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει στερεό θρεπτικό υλικό υπό μορφή κεκλιμένου επιπέδου και το αφήνουμε για επώαση για 48 ώρες.

Όταν ολοκληρωθεί η επώαση βάζουμε τους δοκιμαστικούς σωλήνες στο ψυγείο (-20 °C) για συντήρηση, αφού προσθέσουμε 1 mL αποστειρωμένης γλυκερίνης. Έτσι έχουμε απομονώσει στελέχη ζυμών σε στερεή και σε υγρή μορφή.

Για τα γαλακτικά βακτήρια αλλάζει ο χρόνος επώασης (7-10 ημέρες) και το θρεπτικό μέσο.

Τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιούνται είναι τα εξής:

α) Για ζύμες:
Y.P.D-Chloraphenicol (broth):
1.D-γλυκόζη 20g/L
2.Πεπτόνη 10 g/L
3.Εκχύλισμα ζύμης 10 g/L
4.Chloraphenicol 10 g/L

Αποστείρωση στους 120 °C για 15 λεπτά και pH=4.5

H Chloraphenicol προστίθεται στο Y.P.D θρεπτικό υπόστρωμα για να εξασφαλιστεί μόνο η ανάπτυξη των ζυμών. Η στερεοποίηση γίνεται με προσθήκη agar 20 g/L.

β) Για γαλακτικά βακτήρια:

M.R.S. broth:
1.Πεπτόνη 10 g/L
2. Εκχύλισμα κρέατος 8 g/L
3. Εκχύλισμα ζύμης 4 g/L
4. CH3COONa 3H2O 5 g/L
5. K2HPO4 2 g/L
6. Κιτρικό αμμώνιο 2 g/L
7. MgSO4 7H2O 0.2 g/L
8. MnSO4 4H2O 0.05 g/L
9. Γλυκόζη 20 g/L
10. Tween 80 1 mL
11. Πιμαρισίνη 0.1 g/L

Αποστείρωση στους 115 °C για 15 λεπτά

H πιμαρισίνη προστίθεται στο M.R.S. θρεπτικό υπόστρωμα για να εξασφαλιστεί μόνο των γαλακτικών βακτηρίων.

Χρώση Μικροοργανισμών

Θα χρειαστείτε:

Αντικειμενοφόρος πλάκα
Λαβίδα
Λύχνος Bunsen
Μικροσκόπιο
Διάλυμα χρωστικής crystal violet
Lugol
Διάλυμα της χρωστικής φουξίνης
Αιθανόλη
νερό

Για να μπορούν να παρατηρηθούν οι μικροοργανισμοί στο μικροσκόπιο με μεγάλη λεπτομέρεια, χρωματίζονται. Πριν τη χρώση υφίστανται μονιμοποίηση πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα.

Γιατί γίνεται μονιμοποίηση:

Καταστρέφει την εκλεκτική διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης και επιτρέπει την είσοδο των χρωστικών ουσιών μέσα στο κύτταρο.
Θρομβώνει τις πρωτεΐνες και διαφυλάσσει τη γενική μορφολογία του κυττάρου αφού με τη θρόμβωση οι πρωτεΐνες, δεν διαλύονται στο νερό και δεν εκπλύνονται κατά τη διαδικασία της χρώσης.
Καθιστά ακίνδυνους τους μικροοργανισμούς.

Τι επιτυγχάνεται με τη χρώση:

Αντίθεση μικροοργανισμών και άμεσου περιβάλλοντος.
Διαχωρισμό μικροοργανισμών και ταξινόμηση.

Με τη χρώση Gram, οι μικροοργανισμοί χωρίζονται σε δύο κατηγορίες:

Gram (+): Το κυτταρικό τοίχωμα αποτελείται από μια παχιά στοιβάδα μουρεϊνης με την οποία είναι ενωμένα διάφορα οξέα του κυτταρικού τοιχώματος σε ποσοστό 50%.
Gram (-): Το κυτταρικό τοίχωμα έχει δύο βασικές στοιβάδες, μία εξωτερική που αποτελείται από λιποπρωτεϊνες και λιποσακχαρίτες και μια εσωτερική λεπτή στοιβάδα από μουρεϊνη.

Ρίχνουμε στους μικροοργανισμούς χρωστική Α. Η χρωστική Α είναι το crystal violet που δίνει σκούρο μωβ χρώμα. Πάνω στους βαμμένους μικροοργανισμούς ρίχνουμε μια ποσότητα οργανικού διαλύτη (αιθυλική αλκοόλη). Στα Gram (-) βακτήρια, ο οργανικός διαλύτης διαλύει τη στοιβάδα των λιποσακχαριτών, η λεπτή στοιβάδα της μουρεΐνης καθίσταται περατή, δηλαδή δεν συγκρατεί το σύμπλοκο [Ι2-ΚΙ], που διαλύεται στην αλκοόλη και απομακρύνεται. Αντίθετα, στα Gram (+), ο οργανικός διαλύτης απλά αφυδατώνει την παχιά στοιβάδα της μουρεΐνης, μειώνοντας την διαπερατότητά της και καθιστώντας αδύνατη την έξοδο του συμπλόκου [Ι2-ΚΙ] και την είσοδο της χρωστικής Β. Στη συνέχεια ρίχνουμε στους μικροοργανισμούς χρωστική Β. Η χρωστική Β είναι η φουξίνη που δίνει το κόκκινο χρώμα. Η χρωστική Β χρωματίζει τα Gram (-), ενώ τα Gram (+) παραμένουν χρωματισμένα με τη χρωστική Α.

Αναδευτήρας Vortex

€225,00 με Φ.Π.Α 314015

Χαρακτηριστικά Vortex Mixer:

Αθόρυβη λειτουργία
Σταθερός και συμπαγής σχεδιασμός
Διαθέσιμοι προσαρμογείς για σωλήνες
Συνεχής λειτουργία ή λειτουργία αφής
Ηλεκτρονικός έλεγχος ταχύτητας για σταθερή ταχύτητα ακόμη και κατά τις αλλαγές στο φορτίο

Τα ανταλλακτικά του περιστροφικού κινητήρα δεν περιλαμβάνονται! Είναι διαθέσιμα κατόπιν παραγγελίας.